Wir freuen uns mitteilen zu können, dass unsere Ergebnisse nun offiziell online in Nature Methods veröffentlicht wurden! Zusammen mit Prof. Don C. Lamb und Prof. Thorben Cordes von der Ludwig-Maximilians-Universität München haben wir die Zuverlässigkeit und Genauigkeit von Einzelmolekül-FRET-Studien in einer internationalen Blindstudie mit 19 Labors unter Verwendung dynamischer Proteinsysteme untersucht. Als Referenzsysteme wurden das Maltose-Bindungsprotein der ATP-Bindungskassette und die verkürzte Version des Spleißfaktors U2AF2 ausgewählt, die sich sowohl in der Zeitskala als auch in der Komplexität der Konformationsdynamik unterscheiden. Wir haben gezeigt, dass Einzelmolekül-FRET-Studien in der Lage sind, die Dynamik und die damit verbundenen strukturellen Veränderungen zuverlässig zu erkennen und mit einer Präzision von ≤ 2Å und einer Genauigkeit von ≤ 5Å zu quantifizieren. In dem Artikel gibt es noch viel mehr zu lesen, wobei einige der Höhepunkte praktische Diskussionen über Versuchsaufbauten, Datenqualität und Kalibrierungsunsicherheit sind. Wir zeigen, dass der Fehler bei der Kalibrierung und insbesondere der Fehler beim γ-Parameter der wichtigste Faktor ist, der die Präzision von smFRET-Messungen begrenzt. So ist die Präzision bei relativen RET-Messungen am höchsten (z. B. bei unterschiedlichen Bedingungen (+/-) Ligand). Darüber hinaus haben wir uns mit der seit langem bestehenden Problematik des Nachweises und der Korrektur von Farbstoffanhaftungen befasst und konnten die untere Grenze für den Nachweis von kleinräumigen Abstandsfluktuationen in der Größenordnung von ≤ 5Å bestimmen.
hier finden sie den Artikel (engl.) der HHU: https://www.hhu.de/en/news-article/biomolecules-demonstrating-the-precision-of-optical-nanometer-measurements-for-size
Unser Open-Access-Artikel ist zu finden unter: https://www.nature.com/articles/s41592-023-01807-0
Agam, G., Gebhardt, C., Popara, M., Mächtel, R., Folz, J., ... , Barth, A., Seidel, C.A.M., Lamb, D.C. and Cordes, T., Reliability and accuracy of single-molecule FRET studies for characterization of structural dynamics and distances in proteins. Nat Methods (2023).